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Title: Taxonomia molecular do complexo Bichromomyia flaviscutellata (Diptera: Psychodidae) e estrutura genética de Bichromomyia flaviscutellata sensu stricto, principal vetor da Leishmania amazonensis (Kinetoplastea: Trypanosomastidae)
Authors: Melo, Leonardo
metadata.dc.contributor.advisor: Scarpassa, Vera Margarete
metadata.dc.contributor.co-advisor: Baiatone, Ronildo
Keywords: DNA Barcode
B. flaviscutellata
Estrutura genética
Complexo de espécies
Issue Date: 25-Apr-2019
metadata.dc.publisher.program: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva - GCBEv
Abstract: Phlebotomines are small insects belonging to the order Diptera, family Psychodidae, subfamily Phlebotominae that are subdivided into several genera. Some species of this group are considered transmitters (vectors) of pathogens that cause Leishmaniasis in some vertebrate animals, including man. Bichromomyia flaviscutellata is a complex composed of at least three species: B. flaviscutellata s.s., B. reducta and B. olmeca. The latter is composed of three subspecies: B. olmeca olmeca, B. olmeca bicolor and B. olmeca nociva, which are distributed from Central America to South America. Of these species, B. flaviscutellata s.s. is the main vector of Leishmania amazonesis in Brazil. The present study aimed to molecularly identify the species and subspecies of the B. flaviscutellata complex using the 5' region of the COI gene (known as DNA Barcode) and to verify the genetic structure of B. flaviscutellata s.s. using the 3' region of the gene COI to the variable region. The sequences of the Barcode DNA of the specimens (n = 49) were from six localities, five in the State of Amazonas (Autazes, Manaus, Pitinga, Novo Airão and Rio Preto da Eva) and one (1) in the State of Pará while the sequences of the Variable Region (n = 86) were from the State of Amazonas (Autazes, Manaus, Pitinga, Novo Airão and Rio Preto da Eva). In the Barcode database were added sequences of B. olmeca olmeca and B. olmeca bicolor from Genbank. The consensus sequences of the Barcode DNA showed 649 base pairs (bp) that generated 29 haplotypes and five unconnected networks. Intraspecific genetic distances ranged from 0.000 to 0.037, while interspecific distances ranged from 0.11 to 0.13, with a barcoding gap of 0.087. Phylogenetic analyzes using the algorithms and evolutionary models Neighbor - Joining (NJ - K2P), Maximum Likelihood (ML - HKY + I + G) and Bayesian Inference (BI - HKY + I + G) resulted in topologies with highly supported clades . All trees presented the same topology, but with variations in support values. The relationship between B. olmeca olmeca and B. olmeca bicolor was better clarified in NJ analysis; however, these data, together with those of genetic distances, confirm the position of B. olmeca bicolor as a subspecies of B. olmeca olmeca. Curiously, the topologies of the trees showed the B. olmeca nociva most phylogenetically closer of B. flaviscutellata s.s., as well as the haplotype network separated B. olmeca nociva of B. olmeca olmeca and B. olmeca bicolor. The RV consensus sequences presented 1141 bp and generated 59 haplotypes, showing great variability within B. flaviscutellata s.s. Intraspecific genetic distance between the populations Rio Preto da Eva and Autazes presented the highest value (0.0166). The intrapopulational analysis of the B. flaviscutellata s.s samples from the city of Rio Preto da Eva showed a higher level of genetic differentiation with a value of 0.0167 (1.67%). The Tajima D test was negative but non-significant for all populations, indicating no significant deviation from the neutral evolution model. However, the Fu Fs test was negative and significant for four of the five populations (Autazes, Manaus, Novo Airão and Pitinga), indicating a recent population expansion. The greatest genetic differentiation, using the Fst coefficient and the lowest gene flow, using the Nm coefficient, was between Pitinga and Rio Preto da Eva (Fst = 0.3535; Nm = 0.91). The genetic structure estimated by AMOVA was high and significant, proving that this species is genetically structured. However, the Mantel test was negative and non-significant, which means that this structuring is not related to the Isolation-by-Distance (IBD) model. The presence of shared haplotypes between the populations of Manaus (situated on the left side of the Rio Negro) and Novo Airão (situated on the right side of the Negro River) and the populations of Manaus / Pitinga (situated on the left side of the Solimões River) and Autazes located on the right side of the Solimões River) indicate that the Amazonas / Negro and Solimões River systems are not acting as geographical barriers that impede the gene flow between the populations of B. flaviscutellata s.s. The results of phylogenetic analyzes, together with the haplotype network, genetic distances and morphological characters, suggest that the B. olmeca nociva subspecies should be elevated to the species category.
metadata.dc.description.resumo: Flebotomíneos são pequenos insetos pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae que estão subdivididos em vários gêneros. Algumas espécies desse grupo são consideradas transmissoras (vetores) de agentes patogênicos que causam a Leishmaniose em alguns animais vertebrados, incluindo o homem. Bichromomyia flaviscutellata é um complexo constituído de pelo menos três espécies: B. flaviscutellata s.s., B. reducta e B. olmeca. Esta última é composta de três subespécies: B. olmeca olmeca, B. olmeca bicolor e B. olmeca nociva, que estão distribuídas desde a América Central até a América do Sul. Destas espécies, B. flaviscutellata s.s. é o principal vetor de Leishmania amazonesis no Brasil. O presente estudo objetivou identificar molecularmente as espécies e subespécies do complexo B. flaviscutellata, com o emprego da Região 5’ do gene COI (conhecido como DNA barcode) e verificar a estrutura genética de B. flaviscutellata s.s., usando a Região 3’ do gene COI a região variável. As sequências do DNA Barcode dos espécimes (n=49) foram procedentes de seis localidades, sendo cinco no Estado do Amazonas (Autazes, Manaus, Pitinga, Novo Airão e Rio Preto da Eva) e uma (1) no Estado do Pará (Serra do Cachorro), enquanto as sequências da Região Variável (n=86) foram procedentes do Estado do Amazonas (Autazes, Manaus, Pitinga, Novo Airão e Rio Preto da Eva). No banco de dados do Barcode foram adicionadas sequências do Genbank, de B. olmeca olmeca e B. olmeca bicolor. As sequências consenso do DNA Barcode apresentaram 649 pares de bases (pb) que geraram 29 haplótipos e cinco redes não conectadas. As distâncias genéticas intraespecíficas variaram de 0,000 a 0,037, enquanto as distâncias interespecíficas variaram de 0,11 a 0,13, apresentando um barcoding gap de 0,087. As análises filogenéticas usando os respectivos algoritmos e modelos evolutivos Neighbor-Joining (NJ - K2P), Máxima Verossimilhança (MV – HKY+I+G) e Inferência Bayesiana (IB – HKY+I+G), resultaram em topologias com clados altamente suportados. Todas as árvores apresentaram a mesma topologia, mas com variações nos valores de suporte. A relação B. olmeca olmeca e B. olmeca bicolor foi melhor esclarecida na análise de NJ; entretanto, esses dados, junto aos de distâncias genéticas, comprovam a posição de B. olmeca bicolor como subespécie de B. olmeca olmeca. Curiosamente, as topologias das árvores mostraram B. olmeca nociva mais próxima filogeneticamente de B. flaviscutellata s.s., assim como a rede de haplótipos separou B. olmeca nociva de B. olmeca olmeca e B. olmeca bicolor. As sequências consenso da RV apresentaram 1141 pb e geraram 59 haplótipos, mostrando grande variabilidade dentro de B. flaviscutellata s.s. A distância genética intraespecífica entre as populações Rio Preto da Eva e Autazes apresentou o maior valor (0,0166). A análise intrapopulacional das amostras de B. flaviscutellata s.s do munícipio de Rio Preto da Eva mostraram-se com um maior nível de diferenciação genética com valor de 0,0167 (1,67%). O teste D de Tajima foi negativo, mas não-significante para todas as populações, indicando nenhum desvio significante do modelo neutro de evolução. Entretanto, o teste Fs de Fu foi negativo e significante para quatro das cinco populações (Autazes, Manaus, Novo Airão e Pitinga), indicando uma recente expansão populacional. A maior diferenciação genética, usando o coeficiente Fst e o menor fluxo gênico, usando o coeficiente Nm, foi entre Pitinga x Rio Preto da Eva (Fst = 0.3535; Nm = 0.91). A estruturação genética estimada pela AMOVA foi alta e significante, comprovando que esta espécie é geneticamente estruturada. Entretanto, o teste de Mantel foi negativo e não significante, o que significa que essa estruturação não está relacionada ao modelo de isolamento por distância (IBD – Isolation-by-Distance). A presença de haplótipos compartilhados entre as populações de Manaus (situado no lado esquerdo do Rio Negro) e Novo Airão (situado no lado direito do Rio Negro) e as populações de Manaus/Pitinga (situados no lado esquerdo do Rio Solimões) e Autazes (situado no lado direito do Rio Solimões) indicam que os Sistema fluvial Amazonas / Negro e Solimões não estão atuando como barreiras geográficas que impedem o fluxo gênico entre as populações de B. flaviscutellata s.s. Os resultados das análises filogenéticas, juntamente com a rede de haplótipos, as distâncias genéticas e os caracteres morfológicos, sugerem que a subespécie B. olmeca nociva deve ser elevada à categoria de espécie.
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