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Título: Identificação da composição da ictiofauna do Rio Tarumã-Mirim utilizando o dna ambiental metabarcoding
Autor: Batista, Larissa Matos
Orientador: Val, Vera Maria Fonseca de Almeida e
Coorientador: Sá-Leitão, Carolina Sousa de
Palavras-chave: DNA ambiental
Metabarcoding
Data do documento: 21-Set-2020
Editor: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Programa: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva - GCBEv
Abstract: The metabarcoding approach for environmental DNA (eDNA) aims to identify the diversity of taxa and the composition of biodiversity, using universal primers for molecular taxonomic identification for such purposes. The eDNA method has grown considerably in recent years, however, most studies are still concentrated in temperate regions, causing a lack of clarity about the potential of the method in tropical regions. Therefore, the aim of this study was to apply the use of metabarcoding eDNA for the ichthyofauna composition of the Tarumã-Mirim river, a tributary of the Negro river, and for this we used a universal primer pair (gene 12S rRNA) developed by Miya et al. (2015) for teleost fish. Fragments of the 12S rRNA gene (~ 178 base pairs) were sequenced to build the genetic database, for some species of fish in the Amazon River basin. The species were collected using mesh nets, and 58 species were captured for 18 families. White muscle samples were collected and stored in absolute alcohol for total DNA extraction and for that we used the protocol described by Sambrook et al. (1989). The products of the Polymerase Chain Reactions (PCR) were sequenced using the method of Sanger in an automatic sequencer ABI 3130XL. The sequences were visualized and edited using the Geneious software. For the eDNA metabarcoding method, 30 liters of water were collected for the entire length of the Tarumã-mirim river, distributed in 15 collection points. The water samples were stored in styrofoam boxes with ice and taken to the laboratory for filtration (glass fiber filters) of the samples, and later, construction of the metabarcoding libraries (15 libraries) for sequencing on the Illumina - Miseq platform. Bioinformatics analyzes were performed using the OBITools metabarcoding package. Of the 58 species of fish collected, 56 amplified successfully and were sequenced, and two species (Mesonauta festivus and Uaru amphiacanthoides) were discarded to build the genetic bank. In addition, the 56 species, 28 did not have sequences deposited in public genetic banks for the 12S rRNA gene, such result shows that there is still a long way to reduce the deficiency of the reference databases. The metabarcoding data for the eDNA, identified forty-two operational taxonomic units (OTUs), grouped into six orders, eight families and, with the precise identification of seven species. The limitation in the identification of species or the abundance of taxonomic groups for the Tarumã-Mirim river, using the eDNA method, is due to the lack of genetic information for Amazonian fish species in public databases, besides to the own abiotic characteristics of the region. However, the metabarcoding approach for eDNA proved to be capable of identifying the fish species that occur in the Tarumã-Mirim river, but we need to increase our capacity to generate a more robust genetic database for future studies
Resumo: A abordagem metabarcoding para DNA ambiental (do inglês, environmental DNA ou eDNA) tem como finalidade identificar a diversidade de táxons e a composição da biodiversidade, utilizando, para tais fins, sequências iniciadoras (primers) universais para identificação taxonômica molecular. O método do eDNA cresceu consideravelmente nos últimos anos, contudo, a maioria dos estudos ainda se concentra em regiões temperadas, ocasionando falta de clareza sobre o potencial do método em regiões tropicais. Diante disso, o objetivo deste estudo foi iniciar a construção de um banco de dados do gene 12S rRNA dos peixes da Amazônia, e aplicar o uso do eDNA metabarcoding para iniciar a identificação da composição da ictiofauna do rio Tarumã-Mirim, um tributário do rio Negro e, para isso, utilizamos um par de primers universal (gene 12S rRNA) desenvolvido por Miya et al. (2015) para peixes teleósteos. Fragmentos do gene 12S rRNA (~178 pares de bases) foram sequenciados para construção do banco de dados genéticos para algumas espécies de peixes das bacias dos rios Negro/Solimões/Amazonas. As espécies foram coletadas com redes de malhadeira, tendo sido capturadas 58 espécies pertencentes a 18 famílias. As amostras de músculo branco foram coletadas e armazenadas em álcool absoluto para extração de DNA total e, para isso, utilizamos o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). Os produtos das Reações em Cadeia de Polimerase (PCR) foram sequenciados utilizando o método de Sanger em um sequenciador automático ABI 3130XL. As sequências foram visualizadas e editadas utilizando o software Geneious. Para o método do eDNA metabarcoding foram coletados 30L litros de água para os quinze pontos de coleta distribuídos em toda extensão do rio Tarumã- mirim. As amostras de água foram armazenadas em caixas de isopor com gelo e levadas ao laboratório para filtração (filtros de fibra de vidro) das amostras, e posterior construção das bibliotecas metabarcoding (15 bibliotecas) e o sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina – Miseq. As análises de bioinformática foram realizadas utilizando o pacote OBITools metabarcoding package. Das 58 espécies de peixes coletadas, 56 amplificaram com sucesso e foram sequenciadas e duas espécies (Mesonauta festivus e Uaru amphiacanthoides) não amplificaram e foram descartadas momentaneamente para construção deste banco genético. A seguir verificamos que, das 56 espécies, 28 ainda não possuíam sequências depositadas em banco genéticos públicos para o gene 12S rRNA, evidenciando uma grande lacuna e prevendo um longo caminho para ampliar a eficiência dos bancos de dados de referência. Os dados do metabarcoding para o eDNA revelaram quarenta e duas unidades taxonômicas operacionais (OTU), agrupadas em seis ordens, oito famílias e resultaram na identificação precisa de sete espécies. A limitação na identificação de espécies ou abundância de grupos taxonômicos para o rio Tarumã-Mirim, pelo método do eDNA, deve-se à carência de informações genéticas para espécies de peixes amazônicos em banco de dados públicos, além das próprias características abióticas da região (temperatura e pH). Porém, a abordagem metabarcoding para eDNA mostrou ser possível identificar as espécies de peixes que ocorrem no rio Tarumã-Mirim, embora ainda seja necessário aumentar nossa capacidade em depositar e disponibilizar sequências do gene 12S para futuros estudos
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