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Title: Clonagem da superóxido dismutase de Chromobacterium violaceum e expressão heteróloga
Authors: Dutra, Daniel Lúcio Rodrigues
metadata.dc.contributor.advisor: Astolfi Filho, Spartaco
metadata.dc.contributor.co-advisor: Andrade, Edmar Vaz de
Keywords: Engenharia Genética
Vetor de Expressão
Proteína Recombiante
Issue Date: 11-Jul-2006
Publisher: Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia - INPA
metadata.dc.publisher.program: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva - GCBEv
Abstract: The main objective of this work was to isolate the ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) of C. violaceum and induce their expression in Escherichia coli cells harboring sod genes, to evaluate the increase in SOD activity in the recombinant cells exposed to oxidative stress conditions. The sodB1 gene was isolated by PCR, using specific primers, and cloned into pGEM ® -T Easy vector. The amplification reaction could not be optimized for the second set of primers, specific for sodB2 gene. In an attempt to obtain a vector suitable for the regulated heterologous expression of SOD, some strategies were proposed for the construction of vectors with expression under the control of a sterically repressed promoter – srp. The sodB1 gene was then subcloned into vectors pCR4-SRP and pUC-SRP, derived from pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectively, both developed during this project. However, the obtaining of recombinant clones was not possible. Despite the fact that SOD is not a toxic protein for the cell, we tested the hypothesis of the lethality of recombinant clones caused by the overexpression of SOD. Thus, amy and pfu genes were cloned into pUC-SRP, although the clones harboring the gene of interest could not be obtained. We concluded that the expression mechanisms of pUC-SRP and pCR4-SRP vectors may have caused deletery effects to the host cells, and that modifications in their structure should be made for the minimizing of heterologous expression levels, reducing the risk of toxicity for the clones.
metadata.dc.description.resumo: O principal objetivo do trabalho foi isolar as regiões estruturais dos genes sod correspondentes às ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) de C. violaceum e expressá- las em células de Escherichia coli portando os genes sod, para avaliar o incremento da atividade de SOD nas células recombinantes submetidas a condições de estresse oxidativo. O gene sodB1 foi isolado via PCR, utilizando iniciadores específicos, e clonado em vetor pGEM ® -T Easy. Para sodB2, não conseguiu-se otimizar a reação de amplificação. Com o intuito de obter um vetor para expressão heteróloga regulada de SOD foram traçadas estratégias para a construção de vetores com expressão controlada por um promotor estericamente regulado - srp. O gene sodB1 foi então subclonado nos vetores pCR4-SRP e pUC-SRP, derivados de pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectivamente, ambos desenvolvidos a partir deste trabalho. No entanto, não foi possível a obtenção de clones recombinantes. Apesar de SOD não ser uma proteína tóxica para a célula, testou-se a hipótese de que a superexpressão desta proteína seria a causa da letalidade dos clones recombinantes. Assim, foram clonados os genes amy e pfu em pUC-SRP. Porém, mais uma vez não foram obtidos clones portando os genes de interesse. Conclui-se então que os mecanismos de expressão do vetor pUC-SRP, bem como de pCR4-SRP, devem ter ocasionado efeitos deletérios às células hospedeiras, e que alterações na sua estrutura devem ser feitas no sentido de minimizar os níveis de expressão heteróloga, reduzindo assim o risco de produção de toxicidade para os clones.
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