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https://repositorio.inpa.gov.br/handle/1/39146| Título: | Caracterização genética de Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) a partir de marcadores moleculares cloroplastidiais e nucleares (ITS e microssatélites) |
| Autor: | Silva, Juliana Nascimento da |
| Orientador: | Batista, Jacqueline da Silva |
| Coorientador: | Nunez, Cecilia Veronica Ramos, Santiago Linorio Ferreyra |
| Palavras-chave: | Genética Vegetal Biologia molecular |
| Data do documento: | 28-Set-2022 |
| Programa: | Genética, Conservação e Biologia Evolutiva - GCBEv |
| Abstract: | Apuruí (Duroia macrophylla) produces high levels of secondary metabolites with bioactive potential, taking into account this biotechnological importance, the objective of this work was to characterize polymorphic genomic regions from chloroplast and nuclear markers (ITS and microsatellites) of D. macrophylla. For this, a DNA extraction protocol by Doyle and Doyle, 1990 was optimized. Among the eight treatments performed, treatment 6 was the one with the highest amount of DNA and a significant difference in relation to the other treatments. In this treatment, fragmentation occurred in an automatic shredder, DNA digestion at 60 °C for 30 minutes and precipitation at 37 °C overnight. Treatments 4, 7 and 8 showed values within the range that indicate purity of DNA in relation to proteins. DNA validation showed that all treatments were susceptible to amplification with the different markers used, but showed different rates of return. The 1:15 diluted DNA showed higher numbers of amplifications, since the dilution helps to reduce the concentration of possible inhibitors. To evaluate the polymorphism, 13 regions of the chloroplast genome and one of the nuclear genome (ITS) were selected. 7289 base pairs (bp) of the chloroplast genome and 607 bp of the nuclear genome were recovered. Mutations were detected in three of the 14 markers. The D. macrophylla ITS sequences represented four haplotypes, and the genetic diversity indexes were higher for the ITS marker related to chloroplasts. The number of polymorphic sites at the interspecific level ranged from four to 29 for five markers. Genetic distance values for ITS at the intraspecific level ranged from 0.002 to 0.007 and at the interspecific level from 0.015 to 0.065. BlastN and BoldSystems showed higher percentages of similarity with other Rubiaceae species. BlastX allowed achieving results for 11 of the 14 markers. The different markers offer different results when it comes to genetic distance between Duroia species, and at the cogeneric level, some results confirm what has been reported in the literature. The ITS marker showed higher levels of polymorphism, while N and T3 had low levels and the other 11 markers were monomorphic. In this way, the ITS marker may be the most suitable marker based on DNA sequences for carrying out population studies. The microsatellites were obtained from the construction of an enriched genomic library, in which the most frequent repetition motif was of the dinucleotide type (80.6%) and regarding the nature of repetition, the most frequent was of the perfect type (91, 7%). We designed 30 pairs of primers and characterized 24 microsatellite loci (22 polymorphic and 2 monomorphic) in 23 to 36 specimens. The number of alleles ranged from one to nine, with a total of 118. Observed and expected heterozygosity ranged from 0.143 to 0.844 and 0.135 to 0.837, respectively. Six loci did not show Hardy-Weinberg equilibrium, neither linkage disequilibrium nor dropout was detected in any of the loci. The inbreeding coefficient ranged from -0.413 to 0.555 and the informational polymorphism content ranged from 0.124 to 0.803. The developed microsatellite markers could be used to access the genetic variability of the species, due to the polymorphism rates they presented. In addition, they will be able to subsidize conservation and management policies for the species and offer the possibility of heterologous amplification. |
| Resumo: | O apuruí (Duroia macrophylla) produz altos teores de metabólitos secundários com potencial bioativo. Levando em consideração essa importância biotecnológica, o objetivo deste trabalho foi caracterizar regiões genômicas a partir de marcadores cloroplastidiais e nucleares (ITS e microssatélites) de D. macrophylla. Para isso, foi otimizado um protocolo de extração de DNA protocolo de Doyle e Doyle, 1990. Dentre os oito tratamentos realizados, o tratamento 6 foi o que apresentou maior quantidade de DNA e diferença significativa em relação aos demais tratamentos. Neste tratamento, a fragmentação ocorreu em fragmentador automático, a digestão do DNA a 60 °C por 30 minutos e a precipitação a 37 °C overnight. Os tratamentos 4, 7 e 8 apresentaram valores dentro do intervalo que indicam pureza de DNA em relação a proteínas. A validação do DNA mostrou que todos os tratamentos estavam suscetíveis à amplificação com os diferentes marcadores utilizados, porém apresentaram diferentes taxas de rentabilidade. O DNA diluído de 1:15 apresentou maiores números de amplificações, já que a diluição auxilia na redução da concentração de possíveis inibidores. Para avaliar o polimorfismo, foram selecionadas 13 regiões do genoma cloroplastidial e uma do nuclear (ITS). Foram recuperados 7289 pares de base (pb) do genoma cloroplastidial e 607 pb do genoma nuclear. Detectaram-se mutações em três dos 14 marcadores. As sequências de ITS de D. macrophylla representaram quatro haplótipos, e os índices de diversidade genética mostraram-se superiores para o marcador ITS relacionado aos cloroplastidiais. O número de sítios polimórficos no nível interespecífico variou de quatro a 29 para cinco marcadores. Os valores de distância genética para o ITS no nível intraespecífico variaram de 0,002 a 0,007% e no interespecífico de 0,015 a 0,065%. O BlastN e BoldSystems mostraram maiores percentuais de similaridade com outras espécies de Rubiaceae. O BlastX permitiu o alcance de resultados para 11 dos 14 marcadores. Os diferentes marcadores oferecem resultados diversificados quando se trata de distância genética entre espécies de Duroia, e no nível cogenérico, alguns resultados confirmam o que foi relatado na literatura. O marcador ITS apresentou maiores níveis de polimorfismo, enquanto que o N e T3 baixos níveis e os outros 11 marcadores apresentaram-se monomórficos. Desta maneira, o marcador ITS pode ser o marcador baseado em sequências de DNA mais adequado para realização de estudos envolvendo marcadores moleculares. Os microssatélites foram obtidos a partir da construção de uma biblioteca genômica enriquecida, na qual, o motivo de repetição mais frequente foi do tipo dinucleotídeo (80,6%) e quanto à natureza de repetição, o mais frequente foi do tipo perfeito (91,7%). Foram desenhados 30 pares de primers e caracterizados 24 locos microssatélites (22 polimórficos e 2 monomórficos) em 23 a 36 espécimes. O número de alelos variou de um a nove, com um total de 118. A heterozigosidade observada e esperada variou de 0,143 a 0,844 e 0,135 a 0,837, respectivamente. Seis locos não apresentaram equilíbrio de Hardy-Weinberg, não foi detectado desequilíbrio de ligação nem dropout em nenhum dos locos. O coeficiente de endogamia variou de -0,413 a 0,555 e o conteúdo de polimorfismo informativo variou entre 0,124 a 0,803. Os marcadores microssatélites desenvolvidos poderão ser utilizados no acesso a variabilidade genética da espécie, devido às taxas de polimorfismo que apresentaram. Além disso, poderão subsidiar políticas de conservação e manejo para a espécie e oferecer possibilidade de amplificação heteróloga. |
| Aparece nas coleções: | Mestrado - GCBEv |
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