Extração e purificação de inibidores proteolíticos em sementes de leguminosas arbóreas da Amazônia

Abstract

A família Fabaceae é importante na indústria madeireira, como fonte de proteínas vegetais e contém uma grande variedade de biomoléculas com potencial para aplicação industrial, incluindo os inibidores proteolíticos, os quais são proteínas que podem atuar como fonte de aminoácidos sulfurados, na regulação de proteinases endógenas e na defesa das plantas contra o ataque de insetos e patógenos. Os objetivos deste trabalho foram a investigação e caracterização parcial dos inibidores proteolíticos bem como suas propriedades bioquímicas em extratos e frações de sementes de leguminosas arbóreas da flora amazônica: Parkia pendula, Parkia discolor, Parkia multijuga, Parkia nitida e Enterolobium schomburgkii. Os extratos obtidos após extração salina, precipitação por acetona e precipitação por sulfato de amônio foram utilizados para a quantificação protéica e nas etapas de detecção da atividade inibitória contra tripsina e quimotripsina bovina. O extrato total (ET), proveniente da extração salina, foi submetido à cromatografia de afinidade em Sepharose tripsina. As espécies P. pendula, P. discolor e P. nitida, mostraram maiores teores de proteínas nos ET, enquanto as espécies E. schomburgkii e P. multijuga mostraram estes resultados nos sobrenadantes submetidos ao fracionamento por sulfato de amônio a 0-30% e 60-80% de saturação. A atividade inibitória sobre tripsina foi maior nos extratos totais para todas as espécies, com possível perda de atividade após precipitação acetônica e precipitação por sulfato de amônio a 30-60% de saturação para E. schomburgkii. Contudo, a inibição da quimotripsina acima de 50%, foi observada apenas no extrato total e no precipitado cetônico de P. nitida. Os valores das constantes de inibição (Ki) foram de 8,92 x 10-8 M; 6,89 x 10-8 M; 6,15 x 10-8 M, para P. pendula, P. discolor e P. multijuga, respectivamente. Os inibidores de tripsina apresentaram massas moleculares aparentes de 17 kDa (PpTI), 21 kDa (PdTI), 19 kDa (PmTI e PnTI) e 18 kDa (EsTI), bem como afinidade diferenciada contra a tripsina e quimotripsina bovina. Os resultados mostram que, provavelmente, os inibidores pertencem à família Kunitz.