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Variabilidade do domínio IIS6 do gene do canal de sódio, associada à resistência aos inseticidas piretróides, em populações de Anopheles darlingi e Anopheles marajoara da Amazônia brasileira
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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Resumo
Mutações não sinônimas no domínio IIS6 do gene do canal de sódio (NaV) têm sido
frequentemente associadas à resistência aos piretróides em diversas espécies de anofelinos.
Neste trabalho, foi realizada a primeira investigação da diversidade nucleotídica dessa região
em duas importantes espécies vetoras de malária humana no Brasil, Anopheles darlingi e
Anopheles marajoara. Uma região parcial do domínio IIS6 foi sequenciada de fêmeas adultas,
capturadas dentro e fora dos domicílios, das cidades de Manaus e Coari (AM), e larvas mais e
menos susceptíveis à deltametrina, das cidades de Manaus, São Gabriel da Cachoeira e
Iranduba, no estado do Amazonas, Rio Branco, no Acre, e Macapá, no Amapá. Além disso,
um bioensaio simplificado de knockdown usando larvas foi adaptado para avaliar o status de
susceptibilidade ou tolerância dos anofelinos neotropicais. Com base nesse bioensaio foram
evidenciadas perdas de susceptibilidade nas populações do estado do Amazonas (A. darlingi:
Manaus; A. marajoara: Iranduba). A análise da diversidade nucleotídica do NaV de A.
darlingi revelou cinco sítios polimórficos, que agruparam as amostras em cinco distintos
haplótipos (A, B, C, D e I). Em A. marajoara foram evidenciados quatro sítios polimórficos,
que agruparam as amostras em quatro haplótipos (E, F, G e H). Todas essas substituições
foram sinônimas e mutações kdr (knockdown resistance) no sítio 1014 não foram detectadas,
o que sugere a ocorrência de outros mecanismos de resistência relacionados com a perda de
susceptibilidade à deltametrina, como por exemplo, resistência metabólica. Muito embora
mutações kdr não tenham sido encontradas, é importante ressaltar que sua ocorrência é
permissiva, uma vez que o códon do sítio 1014 dessas duas espécies é formado por TTA, e
uma única mutação (TTT ou TCA) pode mudar o aminoácido para fenilalanina ou serina,
conforme observado em outros insetos. A sequência de aminoácidos traduzidos da região
gênica analisada revelou total homologia com a de outros anofelinos dispostas nos bancos de
ix
dados públicos e as diferenças nucleotídicas observadas estiveram de acordo com a filogenia
das espécies. Não foi possível correlacionar a frequência de alguns dos haplótipos com a
perda de susceptibilidade ao inseticida ou com as fêmeas capturadas dentro ou fora dos
domicílios. A presente análise da região parcial do domínio IIS6 do gene NaV de A. darlingi e
A. marajoara representa uma oportunidade ímpar para a compreensão da diversificação
evolutiva de um gene diretamente relacionado com resistência aos piretróides. Além disso,
descrevemos pela primeira vez a padronização de um teste de susceptibilidade rápido, simples
e de baixo custo, em larvas de anofelinos. Todas essas informações poderão ser usadas pelos
órgãos competentes para direcionar as medidas estratégicas a serem adotadas para combater
os vetores da malária.
Abstract:
Non synonymous mutations in the IIS6 domain of the voltage-gated sodium channel gene
(NaV) have been frequently associated with resistance to pyrethroids in several species of
anophelines. In this work, the first investigation of the nucleotide diversity of this region was
carried out in Anopheles darlingi and Anopheles marajoara, two main human malaria vectors in Brazil. A partial region of the IIS6 domain was sequenced from adults females collectedindoor and outdoor from Manaus and Coari (AM), and most and least susceptible larvae to deltamethrin from Manaus, São Gabriel da Cachoeira, and Iranduba, in the Amazonas State, Rio Branco, Acre, and Macapá, Amapá. In addition, a simplified knockdown bioassay using larvae was adapted to assess the status of susceptibility or tolerance of Neotropical anophelines. The results of the bioassays revealed low susceptibility in the populations from Amazonas State (A. darlingi: Manaus; A. marajoara: Iranduba). The analysis of the nucleotide diversity in the NaV of A. darlingi showed five polymorphic sites that assembled the samples into five haplotypes (A, B, C, D and I). In A. marajoara four polymorphic sites were detected that assembled the samples into four haplotypes (E, F, G and H). All these substitutions were synonymous and the kdr (knockdown resistance) mutations at 1014 site were not detected, suggesting the occurrence of other resistance mechanisms related to the loss of susceptibility to deltamethrin, such as metabolic resistance. Although kdr mutations have not been found, it is important that its occurrence is permissive, once the codon 1014 of these two species is formed by TTA and a single mutation (TTT or TCA) can change the amino acid to phenylalanine or serine as observed in other insects. The amino acid translation
of the region analyzed showed complete homology with other anophelines placed in public
databases and the nucleotide differences observed were in agreement with the phylogeny of xi the species. It was not possible to correlate the frequency of some haplotypes with the loss of susceptibility to the insecticide or females captured indoor or outdoor. Our analysis of the IIS6 domain of the A. darlingi and A. marajoara’s NaV represents a unique opportunity for understanding the evolutionary diversification of a gene directly associated with pyrethroid resistance. Furthermore, we describe for the first time the padronization of a simple, quick and cost effective susceptibility test in anophelines larvae. All this information can be used by the competent institutions to direct the strategic measures to be adopted to combat malaria vectors.
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